Hepatology：单细胞分析显示肝癌干细胞的异质性 | 10×单细胞案例解析

文章信息

论文标题：Single-cellanalysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma

刊登日期：2018年7月

发表杂志：Hepatology

影响因子：14.079

研究机构：美国国家卫生研究院国家癌症研究所、曼谷朱拉蓬研究所、弗雷德里克国家癌症研究实验室

样本类型：肝癌细胞系（HuH1和HuH7) ，手术切除肿瘤样本P1

技术手段：单细胞测序（10X Chromium、SMART-seq）、流式分选

1前言

肝细胞癌（HCC，hepatocellularcarcinoma）的肿瘤内分子异质性部分归因于肝癌干细胞（CSC，hepatic cancer stem cells）的存在。 由各种细胞表面标志物定义的不同CSC群体可能包含不同的致癌驱动因素，这在定义靶向疗法时构成了挑战。 研究人员在单细胞水平（10X Chromium、SMART-seq）上整合转录组学和功能分析用以评估CSC的异质性程度。结果表明，CSC在单细胞水平上的表型、功能和转录均存在异质性，不同的CSC亚群具有不同的分子特征。而且有趣的是，不同CSC亚群内的不同基因与HCC预后相关，并且彼此相互独立，表明CSC异质性影响肿瘤内异质性和肿瘤进展。

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文章结果

大量数据表明CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、EpCAM等表面标志物可以定义CSC，研究人员选择CD24、CD133、EpCAM分选HuH1和HuH7不同细胞亚群，用于研究CSC生物学和分子水平异质性。免疫荧光染色表明，在两种细胞培养形态下（单层培养、球体培养）,两个HCC细胞系均表现出明显的细胞异质性。

HuH1和HuH7细胞系（原始细胞数分别是1343、1134）正常培养和缺氧培养（促进细胞干性）2周后，研究人员依照三种表面标志物（CD24、CD133、EpCAM）分选细胞，HuH1和HuH7中标志物阳性的CSCs比例分别为15-20%、8-12%，而标志物阴性CSCs比例只有0-5%（下图A-B），培养后不同细胞亚群的自我更新能力差异很大（下图C-D）；分选后的细胞经过1个月培养后，和未分选的细胞相比，CD133⁺、EpCAM⁺、CD24⁺、Triple⁺细胞能够扩大成为混合CSCs，而存活下的Triple^-细胞能够扩大成混合CSCs，可能是由于部分细胞不是真正的标记阴性细胞，或者标记阴性细胞经历了转换变为标记阳性细胞（下图E）。

研究人员采用SMART-Seq方式分析HuH1和HuH7阳性标记细胞以及分选的P1（分选CD133⁺/CD24⁺/EpCAM⁺/CD45^-细胞）细胞表达谱（单个细胞测序、10细胞混、100细胞混合测序）信息，并与数据库中人胚胎干细胞（hESC）、鼠内皮细胞（mEC）和鼠造血干细胞（mHSC）表达谱数据做了比较，发现不同细胞类群具有不同的基因表达模式，且不同类型细胞中每个细胞的基因表达模式均存在差异，HuH7细胞间差异大于HuH1；当细胞混合（10细胞混合、100细胞混合）后这种差异程度明显降低（下图A）。而当单独聚类HuH7细胞时，发现不同标记细胞彼此可以区分（下图B）。以上数据均表明单细胞水平上转录组存在异质性。

研究人员比较了HuH7阳性标记细胞（Triple⁺）和阴性标记细胞（Triple^-）基因表达差异，鉴定到的286个Triple⁺相关基因可以预测来自LCI队列的240例肿瘤样本、来自TCGA的250例肿瘤样本的整体生存率，但在非肿瘤样本中无意义。

不同标记CSC细胞群体基因表达比较分析，EpCAM⁺、CD133⁺、CD24⁺、Triple⁺特征基因基本不重合（下图A），IPA通路分析也表明不同细胞群体的通路也不重合（下图C-F），而且不同细胞群体特征基因可以用于生存期预测，且EpCAM⁺、CD133⁺比CD24⁺更有优势（下图B）。

为了整体了解细胞群体多样性，研究人员采用10X 单细胞测序方式，对3847个HuH1、HuH7、P1细胞进行了分析， HuH1可以分为2个亚群，HuH7分为4个细胞亚群，P1分为3个细胞亚群，细胞聚类结果与与SMART-seq结果类似（下图A）。CSC标志物，例如EpCAM、CD133 (PROM1)、CK-19 (KRT19) 和乙醛脱氢酶 (ALDH1A1) （下图B）以及HCC特异基因，AFP、MDK、GPC3、GOLM1、YY1AP1、PLK1,ECT2、NELFE（下图C）在不同细胞亚群中表达存在异质性。P1的3个细胞亚群中表达了3种因子(KLF4、POU5F1、MYC)， 干细胞marker (NANOG)，白细胞marker(PTPRC), T细胞 markers (CD3E, CD8A) 和B细胞marker (CD79A) ，但其表达也存在异质性，其中第一个和第二个P1亚群为HCC浸润白细胞（分别表达T细胞marker和B细胞marker），第三个P1亚群主要为HCC细胞（下图D）。

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